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小鼠單個核細胞分離一步梯度法去除死細胞

2010-06-24 [2280]
基本原理
活細胞(密度較小)和死細胞(密度較大)密度不同,從而有助于將活的淋巴細胞和紅細胞分離。
 
附加材料
高密度溶液:Ficoll-Paque(Ficoll和泛影酸鈉;Pharmacia LKB)或Lympholyte-M(Cedarlane)
12ml或50ml聚丙烯離心管(比聚苯乙烯離心管好)
注:Ficoll-Paque和Lympholyte-M的密度與溫度有關;該方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用。因此應注意使細胞懸液、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會因活細胞沉入離心管底導致在密度界面上損失活細胞。
 
實驗方案
1、用RPMI-5*培養基混懸細胞,分裝到離心管中使其細胞數達到0.5×108~1×108個細胞/2ml(12ml離心管)或1×108~5×108個細胞/5ml(50ml離心管)。
 
2、用移液器吸取3ml(使用12ml離心管時)或5ml(使用50ml離心管時)高密度溶液,將槍頭伸到離心管底,緩慢將高密度溶液加入細胞懸液下方。
 
3、室溫,800g離心15min。為了取得好的分離效果,將離心機的“brake”開關關掉。
 
4、使用5ml移液器,沿高密度層表面緩慢移動移液器槍頭,吸入漂浮在高密度層上方的活細胞,盡量少收集高密度溶液。將活細胞移入另一管中。
 
5、加入RPMI-5*培養基(少量細胞加入10ml,細胞量較多時加入40ml),室溫,200g離心10min。重復一次。
 
6、以適量培養基混懸細胞以便進行下一步操作。


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